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胆道肿瘤基因治疗研究 038

楼主:过眼云烟-2017-03-21 07:57 只看楼主

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导读:胆道肿瘤基因治疗研究
           胆道系统恶性肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。以往曾认为胆道癌为罕见疾病,但是近年来胆道肿瘤发病率有明显上升趋势。胆道癌出现临床症状多属晚期,疗效差,预后不佳。因而对其发病机制的探讨和早期诊断研究正日益引起人们重视。八十年代后期以来,癌基因和抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热门课题,有希望为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一条全新途径。胆道肿瘤的基因研究也逐渐得到人们的关注。 迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有 ras( k- ras, n- ras)、 c- myc、 c- er-2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有 p53、 p16/ mTS1、 aPC、 dCC等。
  1 癌基因:ras基因是一个常见的癌基因家族,由 k- ras, n- ras,和 h- ras三个成员构成。细胞中正常 ras基因编码高度相关的分子量为21000的蛋白质( p21)。 p21是一种鸟嘌呤核苷酸( gTP)结合蛋白,它由188或189个氨基酸组成,和细胞生长和分化密切相关。正常 p21和 gTP结合后激活磷脂酶 c,产生第二信使三磷酸肌醇( iP3)和二酰甘油( dG),之后 gTP被 p21降解,第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的 ras基因发生了突变而变成了癌基因,其所编码的变异 p21蛋白仍能同 gTP结合但是失去了降解 gTP的功能,从而使磷酸脂酶 c持续活化,产生大量 iP3和 dG,引细胞过度增殖,最终发生癌变。 现在已在人类多种肿瘤中检测到了 ras基因突变。40%的结肠癌,50%的肺腺癌,30%的急性白血病中均可检测到 ras基因的突变。其突变的作者单位:中国医科大学第二临床学院肝胆外科(沈阳110003)崔健现在上海医科大学中山医院肝癌研究所(200032)主要方式是点突变,12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中 k- ras基因的突变率高达90%以上,而且突变的位点大多局限于 k- ras基因12位点上。但是对于胆系肿瘤,关于 ras基因突变研究文献极少,而且结果差异很大,甚至还有完全相反的报道。 almoguera应用 rNA酶错配切割法和 dNA直接测序,分析胆道肿瘤的病理标本时,未见任何 ras基因改变。而 tada等应用 dNA测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有 ras基因突变,在胆囊癌中则不存在 ras基因改变。与之相反, levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛 ras基因点突变。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中 k- ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在 k- ras基因改变,而是检测方法灵敏度不够所致。 dNA直接测序时,大约需要20%的细胞发生突变才能得到阳性结果,而 rNA酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为,由于胆道肿瘤是多克隆发病,因而发生 k- ras基因突变的细胞只是一小部分,用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步 pCR- rFLP法(两轮碱基错配 pCR+两轮限制性核酸内切酶酶切)配以 dNA直接测序,发现肝外胆管癌中 k- ras基因突变率为100%。这种方法灵敏度非常高,可以在512个等位基因中检测到一个基因的点突变。 watanabe等应用与 levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本。结果发现55%的胆囊癌、100%的肝外胆管癌均存在 k- ras基因改变。总的突变率为75%。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是 g→ a,使 gGT变成了 gAT,所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生 gGT→ gTT及 gGT→ tTT改变,这些都导致了相应氨基酸改变,因而均是有意义突变。更为重要的是,他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中,表面正常的腺瘤已经发生了 k- ras基因突变,而且突变方式和癌组织完全一样,从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。 ajiki等的研究亦表明 k- ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象。在他们的研究中,胆囊癌、胆管癌、胆囊上皮不典型增生的 k- ras基因12位点的点突变率分别为57%、59%、73%。他们的实验也发现了一个很有意义的现象:9例发生在胆囊癌周围的不典型增生,都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素(如:胆石、长期胆汁酸刺激等)的作用下,胆囊粘膜肠上皮化生→胆囊粘膜不典型增生→胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。 yukama等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展期胆囊癌中 ras基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中 ras基因产物 p21阳性表达率高达95%。胆囊炎为33%。其他癌基因产物如 c- myc、 c- er2、表皮生长因子( eGF)、转化生长因子受体( tGF-eta;)等在胆囊癌都有高表达,平均阳性率在60%左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低,平均在10%以下。 lee等的研究结果也表明,与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比,胆囊癌中 p21呈现强表达,阳性率为62%,胆管癌中 p21阳性率也达到了50%。 p21表达和预后没有明显的关系。以上学者都认为:胆囊癌发病过程中存在着多种基因共同作用,其中, ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与 ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的。 c- er2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体( eGFR)类似物。对于它的研究结果不尽相同。 kamel等的研究结果表明胆囊癌中 c- er2ull;35ull;肝胆胰外科杂志1999年第11卷第1期阳性率大约为10%。胆囊粘膜不典型增生中,其阳性率为0。他们认为 c- er2表达在胆囊癌中是一较晚事件,只有在细胞癌变后才出现。而 yukama等的研究表明 c- er2在早期胆囊癌中阳性表达率为69%。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为 c- er2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一。出现这一不同结果的原因可能是:
  (1).他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。
  (2).所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于 c- er2在胆囊癌发生中到底起何种作用,仍需进一步研究。
  2 抑癌基因:关于抑癌基因,目前研究最多的是 p53基因。 p53定位于人染色体17P13,全长为16-20Kb,由11个外显子构成。正常 p53基因编码野生型 p53蛋白,是一种分子量为53KD的核内磷蛋白。人的 p53蛋白由393个氨基酸组成。 p53基因突变后所编码的蛋白称为变异型 p53。 在人乳腺癌、脑瘤、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现 p53基因突变,总突变率为50%左右。其中83%为错义点突变,6%为无义点突变,10%为插入或缺失突变。 p53的突变并非随机发生,大多数的突变发生于133-299氨基酸。应用 pCR技术研究后发现密码子132-145、171-179、239-248、272-286为突变热点。 野生型 p53蛋白的主要功能是:抗细胞增殖,抑制细胞生长分裂,使细胞停止于 g1期而不进入 s期。野生型 p53可以阻碍 dNA复制起始复合物的装配,抑制 dNA复制,并且在转录水平进行调节,防止细胞过度生长分裂。此外野生 p53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型 p53基因失活的细胞经久处于未成熟状态,持续增生。突变型 p53则不具备以上的功能。 野生型 p53蛋白极不稳定,半衰期很短,而突变型 p53则很稳定,可以在核内积聚,这使得可以用免疫组织化学方法检测到它的存在。突变型 p53的检测可以很好反映 p53基因突变情况。这一点不同于 ras基因。 wee等用 s- p法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中 p53蛋白表达,阳性率分别为73%和64%。他们认为在胆道癌发病过程中, p53基因突变是一个普遍发生的事件,是胆道癌发生内在因素之一。
 kamel等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着 p53基因突变。更为重要的是,在两例胆囊上皮不典型增生的标本中,他们也发现了 p53蛋白阳性表达。 hanada等研究发现,在病理类型为平坦型的胆囊癌中, p53阳性率高于息肉型胆囊癌。而平坦型癌多为浸润癌。 roa的研究也表明,在早期胆囊癌中, p53的阳性率为23.5%,在进展期胆囊癌中, p53的阳性率达到48.2%。在高分化胆囊癌中, p53的阳性率为25%,而在低分化的胆囊癌中, p53的阳性率达到50%。以上研究均提示 p53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
  p16是近年发现的比 p53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因,又称为多肿瘤抑制基因( mTS1)。 p16基因定位于人染色体9P21,由三个外显子构成。总长度为8.5Kb。其编码产物 p16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者。它是细胞周期依赖性激酶4( cDK4)抑制因子。因而又称 mTS1/ p16/ cDK4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶( cDKs)的活化, cDK4和 d型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从 g1→ s期的转变,从而促进细胞增生,这可能是恶性肿瘤发生因素之一。 p16蛋白能和 cDK4结合,抑制细胞转化。近年来有关 p16基因纯合性丢失的研究表明,在人类大部分肿瘤中,均有 p16纯合性丢失,与杂合性丢失一起,总的突变率为50%。碱基突变和缺失另占25%,故在肿瘤组织中 p16总突变率为75%,比 p53的50%的突变率高得多。 1995年, yoshida等人世界上首次报告了 p16基因在胆道肿瘤中的突变情况。他们分析了25例胆道肿瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中 p16/ mTS1的总突变率为64%(其中胆囊癌80%,胆管癌63%),高于 p53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中, p16可能比 p53起更重要的作用。但是 p16在胆系肿瘤中到底作用如何,具体突变方式如何,因目前研究太少,尚不能得出一个明确结论。
  aPC基因和 dCC基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因,前者位于5q21,编码产物分子量超过300,000,调控 ras基因表达。后者也位于5q21,在 aPC附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变,但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q缺失,故认为 aPC和 dCC与胆管癌关系不大。



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作者:游客
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